目前，我国益生菌行业主要依据《食品安全国家标准-食品微生物学检验-乳酸菌检验GB4789.35—2016》对活菌数进行检测。该标准采用了培养法来检测食品中的活菌数。随后，以cDNA为模板进行qPCR反应。目前，有许多研究人员正在积极克服这些局限性，推动拉曼光谱技术的应用，并认为该方法有望成为替代培养法的新一代活菌数检测方法。
编者按：
活菌数是益生菌产品的重要属性之一，因为活菌数可能会影响益生菌产品的效果。活菌数不仅对于益生菌企业和消费者具有重要的意义，对于监管部门而言也十分重要。那么活菌数要怎么检测呢？除了平板培养以外，还有什么其他方法吗？
今天，我们共同关注活菌数的检测，希望本文能够为相关的产业人士和诸位读者带来一些启发和帮助。
活菌检测目前，益生菌行业公认的益生菌定义，是 2001 年联合国粮食及农业组织/世界卫生组织联合工作组提出的：益生菌是指当摄入足够数量时，会对宿主产生健康益处的活性微生物[1]。因此，根据定义，“活性”是益生菌的一个重要特性。
此外，我国 2005 年发布的《益生菌类保健食品申报与审评规定（试行）》中第十二条也明确规定了[2]，活菌类益生菌保健食品在其保质期内活菌数目不得少于10[6] CFU/mL(g)。
因此，准确测定益生菌产品中的活菌数量，对生产商和消费者，以及监管部门来说，都意义重大。
目前，我国益生菌行业主要依据《食品安全国家标准-食品微生物学检验-乳酸菌检验 GB4789.35—2016》对活菌数进行检测。该标准采用了培养法来检测食品中的活菌数。
不过随着技术的不断发展，当前出现了一些检测活菌数量的新方法，其中一些方法具有一定的应用前景，有机会在未来广泛应用于益生菌产品的活菌检测。今天，我们将介绍几种用于活菌检测方法，并探讨不同方法的优劣之处。
基于分离培养：平板计数平板菌落计数法是指将样本进行适当的连续稀释后，取一定量的稀释样液涂布到平板上进行培养，对菌落形成单位（CFU）进行计数，得到现存活菌数量的估计值，并表示为每克或毫升原始样本的菌落形成单位的方法[3]。
该方法的关键在于恰当的原始样品的稀释倍数——将培养后的细菌菌落控制在 30-300 个为宜。
这种活菌检测的方法，是当前应用最广泛、最经典的微生物学检测技术之一，除了被应用于检测食品中的活菌数，它还常常被用于水质的检测[4]。该方法具有成本低、易操作的巨大优势，但同时也有一定的局限性。
平板菌落计数法存在耗时长，难以应付生长缓慢、活的“不可培养的”微生物的缺点。不仅如此，随着益生菌相关研究的不断深入，未来将出现越来越多样的微生物菌种（菌株），对于这些没有培养过的菌株，试验条件都需要摸索与尝试。
除此之外，该方法测定的结果是总活菌数量，无法准确区分益生菌产品中不同菌株细菌的活菌数目，而当前越来越多的益生菌产品采用多菌株，因此急需其他活菌检测方法来弥补上述缺陷。
基于基因表达活性：qPCR转录组可以反映出微生物的活力状态，因此，当前有一些研究人员开始尝试利用细菌的信使 RNA（mRNA），来测定活菌数目。
定量逆转录 PCR（RT-qPCR）是一种用于检测基因转录情况的常见研究方法。在该方法中，信使 RNA（mRNA）首先通过逆转录酶转录成互补 DNA（cDNA）。随后，以 cDNA 为模板进行 qPCR 反应。因此，我们可以选取微生物特定基因的 mRNA 作为检测靶标，利用该方法对样品中的活菌数目进行测定。
为提高基于 mRNA 检测方法的准确性，RT-qPCR 可与叠氮碘化丙锭染色（PMA，可选择性标记死细胞）和 16S rRNA 测序等技术联用[5]，设置死菌阳性对照组，区分出活菌。
目前已有一些文献采用这种方法来检测产品中的活菌数量，比如广泛应用于畜禽养殖中的粪肠球菌[6]。
此种基于基因表达活性的检测方法，具有灵敏度高、特异性强、快速的优势；但样品制备过程中的微小变化，都会影响最终的测定结果，对实验环境和操作人员的要求较高。同时，还需要根据不同的微生物，制定不同的检测靶标和对应标准。
图.流式细胞仪
流式细胞分选技术
随着技术的发展，流式细胞分选技术已经成为生命科学领域的常见实验手段之一。在染色或荧光标记的基础上，可以使用流式细胞分选技术对细菌进行计数。
流式细胞分选技术是一种利用高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的现代细胞分析技术，它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开，并可实现单克隆分选，从而对复杂样本中的细胞进行分类、定量和分离。
流式细胞分选技术具有精确度高，速度快，允许一次检测大量细菌，可对不同的细菌进行分选，检测活菌不同的生理活性和细菌大小的优势[7]。
但由于流式细胞分选技术复杂昂贵，目前主要应用于科学研究，尚未普遍用于益生菌产品的活菌数检验，不过国外已有以此作为出厂检测标准的先例。
图.拉曼光谱结合人工智能快速鉴定微生物
拉曼光谱检测方法1928 年，在研究单色光穿过透明液体介质时，印度物理学家 C.V. Raman 首次发现，入射光中很少一部分光子，与介质产生了非弹性碰撞，即入射光照射在介质上时，与介质的分子或原子发生了能量交换，散射出来的光与入射光的振动频率不同——这就是著名的拉曼光谱效应。
在这一理论基础上，发展起来的分析技术被称为拉曼光谱技术，可广泛应用于液体、气体和固体的检测，且可获得振动频率为 50-4000cm[-1 ]的分子指纹信息[8]。因此，它已被广泛用于多个领域的化学及生物分子的鉴定与研究中，如食品检测、生物医药、环境卫生和石油化工等。
拉曼光谱技术也可用于活菌计数。有研究人员曾利用活菌与死菌表面电荷的不同，在活菌表面吸附银离子后进行还原，测试其拉曼增强信号，结果显示经完全灭活的细菌，几乎没有拉曼增强信号，而活菌表面的拉曼增强信号，则非常丰富，以此来辨别活菌[9]。
还有研究人员将分离培养与拉曼光谱技术相结合，以重水制备的营养肉汤培养沙门氏菌，进行氘元素标记，并与共聚焦显微拉曼光谱联用，以氘元素特征拉曼光谱峰，监测区分沙门氏菌为死菌还是活菌[10]。
该技术可从分子水平上，精确反映样品的化学成分组成和分子结构差异，并且表面增强拉曼光谱技术、共聚焦显微拉曼光谱技术的出现，使得其在分析鉴定过程中，更加直观、易于观察和控制，并且结果更加显著，这些优势极大地促进了拉曼光谱技术的发展。
不过由于该技术还在研究之中，所以仍有一些问题需要克服。比如该技术难以区分不同组分拉曼峰的叠加，易出现某些待测物质峰被掩盖，造成某些组分信息不能完全展现，从而影响最终结果的准确性。
目前，有许多研究人员正在积极克服这些局限性，推动拉曼光谱技术的应用，并认为该方法有望成为替代培养法的新一代活菌数检测方法。
其他方法：细菌的产物除了拉曼光谱之外，还有一些新型的检测活菌的方法。益生菌在生长和发酵过程中，可能会分泌一些物质或放出一些气体，在这些生物标记物的基础上，也可以通过检测活菌产生的分泌物或气体的量，间接确定活菌的数目。
潜在的可用于活菌检测的分泌物有：III 型分泌蛋白 SpaO、蛋白质前体易位酶等[11]。
此外，一些益生菌会产生短链脂肪酸等酸性物质，使样品的 pH 值降低，用溴甲酚紫、酚酞、硝基酚等作为 pH 指示剂，或利用高精度的 pH 计，检测 pH 值的变化量，从而换算出产酸量，并推算出活菌数目[12]。
这类新型的检测方法想象空间巨大，但目前仍然很不成熟，并且利用生物标记物区分死活菌的标准仍不全面。但是，相信在不久的将来，这些活菌检测手段会逐渐成熟，为我们检测活菌数提供更多的可能。
参考文献：
[1] Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting for the Evaluation of Probiotics in Food. London, Ontario, Canada: FAO/WHO; 2002. Guidelines for the evaluation of probiotics in food.
[2] 益生菌类保健食品申报与审评规定(试行)[J]. 中国食品卫生杂志, 2005(04):369-370.
[3] Davis C . Enumeration of probiotic strains: Review of culture-dependent and alternative techniques to quantify viable bacteria - ScienceDirect[J]. Journal of Microbiological Methods, 2014, 103:9-17.
[4] Rygala A, Berlowska J, Kregiel D. Heterotrophic Plate Count for Bottled Water Safety Management. Processes. 2020; 8(6):739. https://doi.org/10.3390/pr8060739
[5] McCarty, S.C., Atlas, R.M. Effect of amplicon size on PCR detection of bacteria exposed to chlorine. PCR Methods Appl. 1993, 3, 181–185.
[6] Tan G, Zhou R, Zhang W, et al. Detection of Viable and Total Bacterial Community in the Pit Mud of Chinese Strong-Flavor Liquor Using Propidium Monoazide Combined With Quantitative PCR and 16S rRNA Gene Sequencing. Front Microbiol. 2020;11:896. Published 2020 May 26. doi:10.3389/fmicb.2020.00896
[7] Tracy, B.P., Gaida, S.M., Papoutsakis, et al. Flowcytometry for bacteria: enablingmetabolic engineering, synthetic biology and the elucidation of complex phenotypes. Curr. Opin. Biotechnol. 2010, 21, 85–99.
[8] Srivatsan T S. Practical Raman Spectroscopy: An Introduction[J]. Materials and Manufacturing Processes，2014. 29(5): 649-649.
[9] Zhou H, Yang D, Ivleva N P, et al. Label-Free in Situ Discrimination of Live and Dead Bacteria by Surface-Enhanced Raman Scattering[J]. Analytical Chemistry，2015. 87(13): 6553-6561.
[10] 冯敬敬. 拉曼光谱在食品包装和生物污染物快速检测中的应用[D]. 江南大学, 2019.
[11] Gao, R, Liao, X, Zhao, X, Liu, D, Ding, T. The diagnostic tools for viable but nonculturable pathogens in the food industry: Current status and future prospects. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2021; 20: 2146– 2175. https://doi.org/10.1111/1541-4337.12695
[12] https://www.sas.upenn.edu/LabManuals/biol275/Table_of_Contents_files/14-Enumeration.pdf
作者｜Jessica
审校｜617
编辑｜笑咲
